單核苷酸多態性（SNP）檢測
單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，包括堿基的顛換、轉換、插入和缺失。它是人類可遺傳變異中最常見的一種，占所有已知多態性的90%以上。SNP作為第三代分子標記，被廣泛應用于分子遺傳學、法醫物證檢驗以及疾病診斷和治療等眾多領域。
一、檢測方法介紹
1、測序法
Sanger測序是DNA序列分析的經典方法，可直接獲取核酸序列信息，是SNP檢測的“金標準”。而且，Sanger測序可發現未知的 SNP位點，確定SNP 的突變類型和突變位置，是一種無法替代的最直接、最準確的SNP檢測方法。
2、TaqMan探針法
TaqMan探針是一種雙標記、自淬滅的水解探針，其5’和3’末端分別標記熒光基團和淬滅基團，在探針結構完整時兩者距離較近，熒光基團的信號可被淬滅。而在PCR擴增過程中，若TaqMan探針與靶標序列完全匹配，探針則可結合在DNA模板上，此時Taq酶延伸至探針位置時，其外切酶活性將切割水解探針，釋放熒光基團，使得熒光信號增強。而且，隨著擴增產物的增多，熒光信號越來越強，從而可通過儀器實時監測熒光信號的變化過程。
3、ARMS-PCR法
擴增阻滯突變系統PCR(Amplification Refractory Mutation System PCR,ARMS-PCR)，又稱為等位基因特異性PCR(Allele-Specific PCR, AS-PCR)，是基于Taq DNA 聚合酶無法修復引物3’末端的單個堿基錯配，從而使得擴增受阻的檢測方法。在擴增過程中，只有當引物3’末端的堿基與SNP位點的等位基因互補配對時，才能正常延伸擴增；而當引物3’末端的堿基與SNP位點的等位基因不互補配對時，則不發生擴增反應，由此對擴增產物進行凝膠電泳或熒光PCR檢測，則可確定SNP基因型。
4、分子信標法
分子信標是一段雙標記的寡核苷酸探針，其5’末端和3’末端分別標記熒光基團和淬滅基團，且探針5’端和3’端的部分堿基可互補配對，從而形成莖環結構，使得熒光基團和淬滅基團相互靠近而熒光信號較低。分子信標的環狀結構部分包含SNP檢測位點，當模板與分子信標環狀結構的核酸序列完全匹配時，分子信標可與模板雜交形成伸展狀態，從而導致熒光基團和淬滅基團的空間距離拉大，熒光信號增強，因此可被儀器檢測，并確定SNP位點。
5、高分辨率熔解曲法
高分辨熔解曲線分析技術(high-resolution melting analysis, HRM)是通過特定染料與擴增后產物結合后形成特定的熔解峰進行分析檢測的方法，其使用的特料為飽和熒光染料，具有更強的DNA結合能力，且不影響PCR擴增，在DNA解鏈過程中也不會發生重排，使得熔解曲線具有更高的分辨率。
6、CAPS法
酶切擴增多態性序列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence, CAPS)，又稱限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)，是PCR技術與RFLP技術相結合的檢測方法。該方法基于DNA片段在酶切位點上的堿基變異，采用相應的限制性內切酶，對該DNA片段的PCR擴增產物進行酶切，從而產生不同的電泳圖譜，由此確定SNP位點的堿基類型。
7、SNaPshot法
SNaPshot是美國應用生物公司(ABI)開發的一種商業技術，是基于熒光標記的單堿基延伸原理，而建立起來的分型技術，該方法也被稱為小測序。其引物設計的關鍵是延伸引物的3’末端應緊挨著SNP位點，同時對不同SNP位點可設計不同長度的延伸引物，這樣便可通過引物長度區分SNP位點。
8、KASP法
KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)是基于引物末端堿基的特異性匹配對SNP進行檢測的方法，該方法在引物和探針設計上與常規熒光PCR不同，首先需針對SNP的等位基因設計兩條對應的上游引物，引物3’末端分別位于各自的SNP位點上，同時引物5’端各自帶有一段獨特的標簽序列，而下游引物則是一條常規設計共用的引物；其次，設計兩條與上游引物標簽序列一致的熒光探針，探針的5’端分別標記不同的熒光基團，同時對應于熒光探針設計各自互補配對的淬滅探針，并在淬滅探針的3’端標記淬滅基團。由此，在擴增未開始時，熒光探針與淬滅探針結合，熒光基團與淬滅基團相互靠近，而無法產生熒光信號。當設計的上游引物中有一條或兩條與模板完全匹配時，則可啟動擴增，其擴增產物再結合下游引物進行擴增，則形成含有標簽序列的DNA片段；該帶有標簽序列的DNA片段可與熒光探針結合，而熒光探針3’端可作為引物啟動擴增，最后形成帶有熒光標記的擴增產物，而且熒光探針對應的淬滅探針則在擴增過程中被切割掉，從而使得擴增過程的熒光信號增強，可對SNP位點進行檢測。
9、基因芯片法
基因芯片(gene chip)是指將大量針對SNP的寡核苷酸探針高密度地固定在一固相支持物表面，從而形成多重寡核苷酸微陣列，而經熒光染料標記后的待測DNA片段，與芯片上固定好的探針陣列進行雜交反應，核酸片段只與其序列完全互補配對的探針雜交，不與含有單個錯配堿基的序列雜交，從而將目標序列固定下來，再通過清洗去除非目標片段，最后通過掃描檢測芯片上的熒光信號，由此確定SNP位點。
10、質譜法
質譜法是基于基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)的檢測方法，其檢測過程中，需通過激光激發DNA分子片段, 再利用飛行時間判斷DNA片段的分子量大小，從而確定SNP位點。其檢測原理同樣使用了單堿基延伸技術，在多重PCR擴增時，其擴增產物將在SNP位點上終止延伸，形成不同分子量的檢測產物，再利用質譜分析獲得圖譜，而不同分子量的延伸產物，在其對應的分子量位置上可查看檢測峰圖，由此確定SNP位點。
二、總結
用于檢測SNP的方法，除了測序法可直接獲取核酸信息外，其它方法均是基于已知SNP位點進行設計的檢測方法。這些方法中，有些技術在擴增檢測原理上類似。如TaqMan探針法和分子信標法均是基于探針的特異性識別來區分檢測SNP位點的，ARMS-PCR和KASP則是基于引物特異性識別SNP位點的檢測方法，SNaPshot法和質譜法則均使用了單堿基延伸技術。
SNP檢測在遺傳疾病的診斷和篩查以及用藥種類和劑量指導等方面有著重要的應用價值。而2019年出現的新型冠狀病毒，作為一種RNA病毒，其在進化演變過程中，也出現了很多SNP位點，其中的一些變異甚至使得新冠的傳染性和毒力存在進一步增強的潛在風險，因而時不時拉響了全球疫情警報。從Alpha、Beta、Mamma到后來的Delta，再到現在的Omicron，面對這些需要關注的變異株(Variants of Concern, VOC)，SNP檢測方法同樣必不可少。
