甲基化檢測
DNA甲基化存在于大多數(shù)真核生物中，一般發(fā)生在CpG雙核苷酸中胞嘧啶的5’UTR區(qū)，起調(diào)控作用。CpG的胞嘧啶大概有80%被甲基化，20%處于基 因調(diào)控區(qū)的CpG島中。BSP甲基化測序（Bisulfite Genomic Sequencing PCR）的原理通過對基因組DNA進行重亞硫酸鹽處理，非甲基化的胞嘧啶被脫氨基而轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，在隨后的PCR反應中尿嘧啶轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不能被脫氨基，在反應完成時被保留，我們將擴增得到的PCR產(chǎn)物進行TA克隆測序，可以分析甲基化發(fā)生的具體情況。該方法實驗結果準確性高，是甲基化檢測的金標準。
近年來涌現(xiàn)出不少DNA甲基化的檢測技術，少說也有十幾種。大致可以分為兩類：特異位點的甲基化檢測和全基因組的甲基化分析，后者也稱為甲基化圖譜分析(methylation profiling)。下面大家介紹一些常用的方法。
一、特異位點的甲基化檢測
1. 甲基化特異性PCR(MS-PCR)
這種方法經(jīng)濟實用，無需特殊儀器，因此是目前應用最為廣泛的方法。在亞硫酸氫鹽處理后，即可開展MS-PCR。在傳統(tǒng)的MSP方法中，通常設計兩對引物，一對MSP引物擴增經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后的DNA模板，而另一對擴增未甲基化片段。若第一對引物能擴增出片段，則說明該檢測位點存在甲基化，若第二對引物能擴增出片段，則說明該檢測位點不存在甲基化。
這種方法靈敏度高，可用于石蠟包埋樣本，且不受內(nèi)切酶的限制。不過也存在一定的缺陷，你要預先知道待測片段的DNA序列，并設計出好的引物，這至關重要。另外，若存在亞硫酸氫鹽處理不完全的情況，那可能導致假陽性。
2. 亞硫酸氫鹽處理+測序
這種方法一度被認為是DNA甲基化分析的金標準。它的過程如下：經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理后，用PCR擴增目的片段，并對PCR產(chǎn)物進行測序，將序列與未經(jīng)處理的序列進行比較，判斷CpG位點是否發(fā)生甲基化。這種方法可靠，且精確度高，能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態(tài)，但需要大量的克隆測序，過程較為繁瑣、昂貴。
3. 聯(lián)合亞硫酸氫鈉的限制性內(nèi)切酶分析法(COBRA)
DNA樣本經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后，利用PCR擴增。擴增產(chǎn)物純化后用限制性內(nèi)切酶(BstUI)消化。若其識別序列中的C發(fā)生完全甲基化(5mCG5mCG)，則PCR擴增后保留為CGCG，BstU I能夠識別并進行切割;若待測序列中，C未發(fā)生甲基化，則PCR后轉(zhuǎn)變?yōu)門GTG，BstUI識別位點丟失，不能進行切割。這樣酶切產(chǎn)物再經(jīng)電泳分離、探針雜交、掃描定量后即可得出原樣本中甲基化的比例。
這種方法相對簡單，可快速定量幾個已知CpG位點的甲基化，且需要的樣本量少。然而，它只能獲得特殊酶切位點的甲基化情況，因此檢測陰性不能排除樣品DNA中存在甲基化的可能。
4. 熒光定量法(Methylight)
此種方法利用TaqMan? 探針和PCR引物來區(qū)分甲基化和未甲基化的DNA。首先用亞硫酸氫鹽處理DNA片段，并設計一個能與待測位點互補的探針，隨后開展實時定量PCR。這種方法最大的優(yōu)勢在于其高通量和高敏感性，且無需在PCR后電泳、雜交等操作，減少了污染和操作誤差。
Qiagen就提供了多種預制的MethyLight分析。EpiTect MethyLight PCR Kit包括了兩條甲基化敏感的TaqMan探針和2條甲基化不敏感的PCR引物。隨著目標序列甲基化狀態(tài)的不同，只有FAM標記的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的甲基化DNA特異的TaqMan探針，或只有VIC標記的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的未甲化的DNA特異的TaqMan探針能與目標序列雜交。如果探針與DNA雜交則釋放出熒光信號。信號強度與PCR產(chǎn)物的量成正比，據(jù)此可計算出樣品的甲基化程度。
5. 甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析
亞硫酸氫鹽處理后，甲基化與未甲基化DNA會存在序列差異，這種差異可通過熔解曲線分析來發(fā)現(xiàn)，因為甲基化DNA含有更多的GC，相對更難熔解。根據(jù)熔解溫度及峰型的變化，可輕易區(qū)分完全甲基化、完全非甲基化或雜合甲基化。高分辨率熔解(HRM)技術可檢出極微小的差別。
使用這種方法進行甲基化分析僅需一對引物，相比以往的方法更加快捷、簡便和精確。不過對儀器的要求頗高，需要帶HRM模塊的熒光定量PCR儀。目前市場上有多款PCR儀可滿足要求，包括Illumina的Eco、QIAGEN的Rotor-Gene Q、羅氏 LightCycler 480等。
6. 焦磷酸測序
焦磷酸測序技術(Pyrosequencing)作為一種新的序列分析技術，能夠快速地檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進行定性及定量檢測，為甲基化研究提供了新的途徑。
通過準確定量單個連續(xù)的CpG 位點上的甲基化頻率，焦磷酸測序本身能檢測并定量甲基化水平上的細微改變。在序列延伸過程中，根據(jù)C和T的摻入量來定量確定單個位點的C-T 比例。因此，不同位點的甲基化變異就能被準確檢測。由于焦磷酸測序提供了真實的序列數(shù)據(jù)，甲基化狀態(tài)也就以序列形式呈現(xiàn)。
QIAGEN目前提供三種焦磷酸測序儀器，通量由低到高，適合不同的應用。PyroMark Q24 的強項在于可對多達24個樣品進行焦磷酸測序。需要大樣品量的應用更適合在PyroMark Q96 ID 上進行。在考慮到處理成百上千個樣品所需的大量試劑時，運行通量最大化可能會使實驗成本變得很高。而PyroMark Q96 MD 裝有一臺高度靈敏的光檢測攝像頭，可以在減少試劑量的情況下對少量的DNA模板進行準確測序。
為配合焦磷酸測序，QIAGEN還推出了PyroMark CpG Assays。這些預設計的甲基化分析使用特別定制的算法來設計出焦磷酸分析所用的PCR和測序引物，從而實現(xiàn)了基因組內(nèi)特異靶點的甲基化分析。
二、基于芯片的甲基化圖譜分析
就甲基化圖譜分析而言，目前流行的分析方法是芯片。多個公司都提供了這種工具，包括安捷倫的Human CpG Island Microarray Kit，Illumina的HumanMethylation27 DNA analysis BeadChip，Roche NimbleGen的Human DNA Meth 2.1M Deluxe Promoter Array和Affymetrix的seven-array GeneChip? Human Tiling 2.0R Array Set。
平臺不同，過程也各異。安捷倫和NimbleGen的分析過程中，基因組DNA分成兩份，一份用來做MeDIP，另一份作為對照。兩個樣品都標記熒光(富集的樣品用Cy5標記，對照用Cy3標記)，然后與芯片雜交。芯片上每個探針的Cy5/Cy3強度比例顯示出該區(qū)域的甲基化程度。
安捷倫的244,000-element array覆蓋了27000多個人CpG島和甲基化不足區(qū)域(UMR)。NimbleGen的Human 2.1M Deluxe Promoter array也覆蓋了27000多個CpG島，還包括了27000多個啟動子區(qū)域，所有這些都是以100 bp的分辨率。然而這兩個平臺都不能以單核苷酸的分辨率報告甲基化狀態(tài)，但是Illumina的Infinium和GoldenGate分析做得到。
Illumina的Infinium HumanMethylation27 BeadChip芯片覆蓋27,578個CpG位點。分析利用兩個位點特異的探針拷問這些化學上差異的位點，一個探針是為甲基化位點(M磁珠類型)設計的，而另一個是為未甲基化位點(U磁珠類型)設計的。探針的單堿基延伸摻入了一個標記的ddNTP，它隨后被熒光試劑染色。通過計算甲基化與未甲基化位點的熒光信號比例，可確定拷問位點的甲基化水平。
此產(chǎn)品雖評價頗高，可惜目前已停產(chǎn)，取而代之的是Infinium HumanMethylation450 BeadChip芯片。它以單堿基分辨率覆蓋了每個樣品中超過45萬個甲基化位點，實現(xiàn)了基因區(qū)域和CpG島的全面覆蓋。此外，還附加了甲基化專家所精選的高價值內(nèi)容，包括CpG島之外的CpG位點，在人類干細胞中鑒定出的非CpG甲基化位點，以及腫瘤和正常組織中差異表達的甲基化位點等等。它的高覆蓋度、高通量以及低價格，讓它成為篩選GWAS群體的理想選擇。
相比之下，VeraCode GoldenGate甲基化分析更適合高通量的驗證研究，它以溶液的形式分析48至384個用戶指定的CpG位點。首先，將亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA與分析oligo混合，oligo與未甲基化位點的U互補，或者與甲基化位點的C互補。雜交之后，引物延伸，并連接上位點特異的oligo來產(chǎn)生通用PCR的模板。最后，用標記的PCR引物生成可檢測的產(chǎn)物。據(jù)Illumina的產(chǎn)品專家介紹，其產(chǎn)品的最大優(yōu)勢在于單個CpG位點的分辨率。其它分析將甲基化定位在一段區(qū)域，而通過Illumina分析，你能精確測定某個CpG位點的甲基化水平。
高通量測序
新一代測序儀的飛速發(fā)展，使得測序成本大幅度下降，也使得甲基化組(methylome)的研究成為可能。近兩年，多個研究小組將傳統(tǒng)的甲基化工具(如DNA的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化)與目標基因組捕獲技術和高通量測序相結合，繪制出了多張甲基化圖譜。
而第三代測序技術的出現(xiàn)，更是讓甲基化的直接測定成為可能。一年前，美國Pacific Biosciences公司利用獨有的單分子實時(SMRT)測序技術，直接測定了DNA的甲基化。這項成果發(fā)表在《Nature Methods》雜志上。
SMRT技術采用的是對DNA聚合酶的工作狀態(tài)進行實時監(jiān)測的方法。DNA聚合酶催化熒光標記的核苷酸摻入到互補的核酸鏈中。核苷酸的摻入被檢測成熒光脈沖，依據(jù)其顏色鑒定出核苷酸。當聚合酶切斷連接在核苷酸末端的熒光基團時，脈沖終止。熒光脈沖的到達時間和持續(xù)時間產(chǎn)生了關于聚合酶動力學的信息，從而允許直接檢測DNA模板鏈中的修飾核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶。
研究人員使用這些動力學特征，鑒定出基因組樣品中的腺嘌呤甲基化，并發(fā)現(xiàn)再結合circular consensus sequencing，他們能夠在單堿基分辨率上鑒定出表觀遺傳學修飾(mA、mC和hmC)。
美國Sequenom公司的MassARRAY? 平臺也可用于DNA甲基化分析。MassARRAY? EpiTYPER? DNA 甲基化分析技術結合了堿基特異性酶切反應和 MALDI-TOF 檢測原理，可實現(xiàn)多重CpG的分析檢測。
堿基特異性酶切(MassCLEAVE)實驗由亞硫酸氫鹽處理待測 DNA 開始。經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理，DNA中未甲基化的胞嘧啶 (C) 轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?U)，由此在DNA模板中產(chǎn)生甲基化特異的序列變化。利用 5’39; 末端帶有T7-啟動子的引物進行 PCR 擴增，產(chǎn)物經(jīng) SAP (蝦堿性磷酸酶)處理后用于堿基特異性的酶切反應。酶切后DNA片段的大小和分子量取決于亞硫酸鹽處理后的堿基變化，飛行質(zhì)譜能測出每個片段的分子量，配套軟件 EpiTYPER 則能自動報告每個相應片段的甲基化程度
