雙熒光素酶實驗
熒光素酶報告基因系統是以熒光素(luciferin)為底物來檢測熒光素酶活性的一種報告系統。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會發出生物熒光(bioluminescence)。然后可以通過熒光測定儀（化學發光儀）測定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光。熒光素和熒光素酶這一生物發光體系，可以極其靈敏、高效地檢測基因的表達。
雙熒光素酶體系，即有兩種熒光素酶，比較常見的組合是螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶，螢火蟲熒光素酶作用于甲蟲熒光素，而海腎熒光素酶在氧的存在下作用于海腎熒光素。以其中一個作為內參對照，即表達量基本恒定，用于減少試驗中不同處理間所固有的變化，包括培養細胞的數目及活力的差異，細胞轉染及裂解的效率，而另外一個熒光素酶則作為報告基因，用于指示不同處理條件下基因的表達情況。
將目的基因轉錄調控原件構建入帶有熒光素酶(Firefly luciferase)的表達載體，構建成報告基因質粒，使這段序列調控luciferase的轉錄表達。然后將報告基因質粒轉染細胞，給予其不同的處理后裂解細胞，并加入底物熒光素(luciferin)，luciferase可催化luciferin發出熒光(最強波長在560nm左右)。檢測得到的熒光值高低可以判斷不同處理組對該轉錄調控原件的影響。為避免由于質粒轉染細胞時效率差異所造成的誤差，通常會轉入Renilla luciferase的報告基因質粒作為內參(最強波長在465nm左右)，即雙熒光報告系統。
雙螢光素酶實驗的具體步驟
1、報告基因質粒的構建。將目的片段插入到熒光素酶表達的報告基因載體上，如pGL3-basic。
2、轉染細胞。將報告基因質粒和phRL-TK(內參)共轉染細胞，根據需要對細胞進行處理。共轉染時，由于內參具有很強的啟動子，因此報告基因質粒：內參轉染量一般為10:1~50:1。
Luciferase活性測定：
⑴ 初次使用時，配制LAR II，即Firefly luciferase的底物。將LAR II溶解在LAR II buffer中，并分裝-80℃避光保存。
⑵ 加入1X PLB，室溫裂解細胞15 min。
⑶配制Stop&Glo，即Renilla luciferase的底物，能夠終止LAR II的反應。
⑷ 測定熒光值。向40 ul的LAR II中加入10 ul細胞裂解液，吹打混勻后，檢測讀數，即為Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo，再次讀數，即為Renilla luciferase的值。
⑸ 數據處理。首先計算出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值，再以control組的比值為單位1，即可得到不同處理組的相對luciferase活性，也就是該處理組基因轉錄的調控活性。
實驗注意事項
1、為保證熒光素酶檢測試劑的穩定性可以采取適當分裝后避光保存的方法，以免反復凍融和長時間暴露于室溫。
2、為取得最佳檢測效果，同一批樣品最好保證相同的測定時間，通常為10 s。
